Elastaza
Stafopaina B

Praktyczne przepisy

Modyfikacja cystein za pomocą bromopropyloaminy (przepis przystosowany do odsalania próbki na HPLC):

Próbkę (maksymalnie 50 nanomoli suchego, pozbawionego soli osadu białka lub peptydu) rozpuścić w 150 ul buforu denaturującego (0,2 M Tris-HCl pH 8,2 zawierający 8 M chlorowodorku guanidyny). Do roztworu dodać 2 ul roztworu ditiotreitolu (39 mg DTT w 500 ul buforu denaturującego), po czym probówkę przedmuchać argonem lub azotem, szczelnie zamknąć i inkubować 1 godz. w temp. 60 st. C. Po inkubacji dodać do mieszaniny 5 ul roztworu bromopropyloaminy (44 mg bromowodorku 3-bromopropyloaminy w 100 ul buforu denaturującego), po czym ponownie probówkę przedmuchać gazem obojętnym, zamknąć i inkubować 2 godz. w temp. 60 st. C. Następnie dodać 40 ul roztworu DTT (39 mg DTT w 100 ul buforu denaturującego) i po przepłukaniu argonem inkubować 30 min w temp. pokojowej. Po tym etapie mieszaninę reakcyjną zakwasić do pH ok. 2,0 poprzez dodanie 5 ul kwasu trifluorooctowego (TFA) i natychmiast poddać operacji odsolenia techniką RP-HPLC. 

Modyfikacja cystein za pomocą bromopropyloaminy (przepis przystosowany do SDS-PAGE):

Próbkę (maksymalnie 50 nanomoli suchego, pozbawionego soli osadu białka lub peptydu) rozpuścić w 30 ul buforu denaturującego (0,2 M Tris-HCl pH 8,2 zawierający 2% SDS). Do roztworu dodać 2 ul roztworu ditiotreitolu (39 mg DTT w 500 ul buforu denaturującego), po czym probówkę przedmuchać argonem lub azotem, szczelnie zamknąć i inkubować 1 godz. w temp. 60 st. C. Po inkubacji dodać do mieszaniny 5 ul roztworu bromopropyloaminy (44 mg bromowodorku 3-bromopropyloaminy w 100 ul buforu denaturującego), po czym ponownie probówkę przedmuchać gazem obojętnym, zamknąć i inkubować 2 godz. w temp. 60 st. C. Następnie dodać 5 ul roztworu DTT (39 mg DTT w 25 ul buforu denaturującego) i po przepłukaniu argonem inkubować 30 min w temp. pokojowej. Po tym etapie mieszaninę zmieszać z odpowiednim buforem do próbek i poddać elektroforezie SDS-PAGE i ewentualnie elektrotransferowi na membranę PVDF. 

S-pirydyloetylacja cystein przy użyciu 4-winylopirydyny (przepis przystosowany do odsalania próbki na HPLC):

Białko rozpuścić w 40 ul 0,2 M Tris-HCl pH 8,4 z dodatkiem 6 M chlorowodorku guanidyny i preinkubować 30 minut w 37 st. C. Dodać 1 ul 1 M DTT (39 mg DTT/0,25 ml wody), co daje końcowe stężenie 20 mM, przedmuchać argonem lub azotemi, inkubować w ciemności 60 minut w 37 st. C. Dodać 2 ul 4-winylopirydyny i inkubować w ciemności 60 minut w temperaturze pokojowej. Próbkę zakwasić i natychmiast odsolić na RP-HPLC. 

Alkilacja cystein przy użyciu akrylamidu (przepis przystosowany do późniejszego odsalania próbki na HPLC):

Białko rozpuścić w 40 ul 0,2 M Tris-HCl pH 8,4 z dodatkiem 6 M chlorowodorku guanidyny i preinkubować 30 minut w 37 st. C. Dodać 1 ul 1 M DTT (39 mg DTT/0,25 ml wody), co daje końcowe stężenie 20 mM, przedmuchać argonem i inkubować w ciemności 60 minut w 37 st. C. Dodać 14 ul 6 M akrylamidu (106 mg/0,25 ml wody), co daje końcowe stężenie 2 M, przedmuchać argonem lub azotem i inkubować w ciemności 60 minut w 37 st. C. Próbkę zakwasić i natychmiast odsolić na RP-HPLC.

Alkilacja cystein przy użyciu akrylamidu (przepis przystosowany do SDS-PAGE):

Białko rozpuścić w 15 ul 0,2 M Tris-HCl, pH 8,4, 100 mM DTT. Dodać 1 ul 20 % SDS w wodzie (200 mg/1 ml), wymieszać (ostrożnie, by nie dopuścić do pienienia) i inkubować w temp. 70 st. C przez 30 min. Dodać 64 ul wody i 26 ul 6 M akrylamidu w wodzie (106 mg/0,25 ml wody), co daje końcowe stężenie 2 M, przedmuchać argonem lub azotem i inkubować w ciemności 60 minut w 37 st. C. Po tym etapie mieszaninę zmieszać z odpowiednim buforem do próbek i poddać elektroforezie SDS-PAGE i ewentualnie elektrotransferowi na membranę PVDF. 

Elektroforeza Tris-Tricine SDS-PAGE:

Elektroforeza ta jest polecana do rozdziału małych białek oraz peptydów o masach ponad 1,5 kDa.

Bufor elektrodowy + (dolny): 0,2 M Tris-HCl pH 8,9 (24,22g/l).

Bufor elektrodowy - (górny): 0,1 M Tris (12,2 g/l) + 0,1 M Tricine (17,9 g/l) + 0,1 % SDS (1 g/l)

Roztwór A: 3 M Tris-HCl, pH 8,45 (72,7 g/200ml) + 0,3 % SDS (0,6 g/200ml) 

Roztwór B: 48 g akrylamid + 1,5 g bisakrylamid /100 ml wody 

Roztwór C: 46,5 g akrylamid + 3 g bisakrylamid / 100 ml wody 

Roztwór D: 10 % nadsiarczan amonu w wodzie 

Dalsze objętości podane dla przygotowania 2 płytek grubości 1 mm w aparacie BioRad MiniProtean II: 

  • żel na próbki: 0,3 ml B + 0,93 ml A + 2,52 ml wody + 45 ul D + 4,5 ul TEMED 
  • żel przejściowy: 1,52 ml B + 2,5 ml A + 3,48 ml wody + 25 ul D + 2,5 ul TEMED 
  • żel do rozdziału białek: 1,83 ml B + 3 ml A + 1 ml glicerol + 3,24 ml wody + 45 ul D + 4,5 ul TEMED 
  • żel do rozdziału peptydów: 3 ml C + 3 ml A + 1 ml glicerol + 2 ml wody + 30 ul D + 3 ul TEMED

Płytkę wylewa się w następujących proporcjach wysokościowych od dołu: 

  • dla rozdziału białek (100-10 kDa) : 6/10 żel białkowy + 3/10 żel przejściowy + 1/10 żel na próbki (bardzo dobrze pracuje też układ 9/10 żel białkowy + 1/10 żel na próbki) 
  • dla rozdziału peptydów (20-1,5 kDa): 6/10 żel peptydowy + 3/10 żel przejściowy + 1/10 żel na próbki

Żel przejściowy należy nawarstwić na rozdzielający jeszcze przed spolimeryzowaniem tego ostatniego i pozostawić całość do polimeryzacji po nawarstwieniu delikatnie wody na górną powierzchnię żelu. Po polimeryzacji zebrać wodę, włożyć grzebień i polimeryzować żel na próbki już bez nawarstwiania wody. 

Bufor do próbek: 125 mM Tris-HCl pH 6,8 + 4 % SDS + 20 % objętościowo glicerol + 50 mg DTT/ml (lub bez DTT w warunkach nieredukujących) + szczypta Coomasie Brillant Blue G-250 (do lekko niebieskiego zabarwienia) (uwaga: CBB G - a nie CBB R). Bufor mieszać w stos. 1:1 objętościowo z próbką i gotować na łaźni wodnej 5 min. 

Elektroforeza: 30 V, gdy próbka jest w żelu na próbki, 50 V, gdy jest w żelu przejściowym i 80 V, aż próbka osiągnie koniec żelu. UWAGA: Jeśli żel ma zostać poddany operacji elektrotransferu na membranę to należy to uczynić natychmiast po zakończeniu elektroforezy, bez uprzedniego barwienia. Jeśli zaś ma on zostać wybarwiony to utrwala się go 30 min. w 50 % metanolu + 10 % kwas octowy i następnie barwi 2 godz. w 0,025 % CBB R-250 w 10 % kwasie octowym. Odbarwia się w 10 % kwasie octowym. 

Elektrotransfer na membranę PVDF:

Bufor 10x: Rozpuścić 22,13 g CAPS (3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid) w 900 ml wody, doprowadzić z NaOH do pH 11,0 i dopełnić do 1000 ml. Przechowywać w lodówce. 

Bufor do elektrotransferu: 100 ml buforu 10x plus 100 ml metanolu plus 800 ml wody. 

Niewybarwiony żel bezpośrednio po zakończeniu elektroforezy delikatnie kołysać w buforze do elektrotransferu przez 1 minutę. 

Uformować "kanapkę": na ramce do elektrotransferu ułożyć nasączoną buforem gąbkę, na niej dwie warstwy bibuły, na bibułach namoczony żel. Na żelu umieścić membranę PVDF do celów sekwencjonowania białek (0,22 um, np. Immobilon-PSQ firmy Millipore, Sequi-Blot firmy BioRad, ProBlott firmy Applied Biosystems), która była uprzednio moczona przez minutę w czystym metanolu a następnie przez minutę w buforze do elektrotransferu. Formowanie „kanapki” zakończyć umieszczeniem na membranie dwóch następnych warstwy bibuły oraz gąbki. Przy formowaniu kanapki starannie usuwać ewentualne pęcherzyki powietrza! Ramkę zamknąć i umieścić w aparacie do elektrotransferu. Plus podłączyć po stronie membrany (minus-żel-membrana-plus).

Transfer prowadzić przez 1,5 godziny przy napięciu stopniowo zwiększanym od kilkudziesięciu do ok. 90 V, tak, by nie przekraczać prądu 200 mA (może dojść do przegrzania cieczy). Po skończonym transferze na minutę umieścić membranę w wodzie na kołysce laboratoryjnej po czym barwić ok. 30 s 0,1 % Coomassie Brillant Blue R-250 w 40 % metanolu i 1 % kwasie octowym (barwnika używać tylko jeden raz!). Wylać barwnik, odbarwiać membranę przez kilka minut w trzech-czterech porcjach 50 % metanolu, przemyć ultraczystą wodą i wysuszyć na powietrzu. Zamiast CBB R-250 można użyć Amido Black w takich samych stężeniach. Odbarwiać wówczas należy w wodzie. W przypadku barwienia z Ponceau S membranę należy barwić 1 minutę w 0,2 % Ponceau S w 1 % kw. octowym po czym odbarwiać we wodzie. 

Roztwory barwników powinny być przygotowane z odczynników maksymalnej czystości i muszą być używane jednorazowo (nie wolno barwić membrany barwnikiem wcześniej używanym do innego celu). Należy pamiętać o używaniu bardzo dokładnie umytych i przepłukanych metanolem naczyń, o stosowaniu wody "HPLC grade" i innych odczynników stopnia czystości co najmniej cz.d.a. Nie wolno używać rękawiczek talkowanych lub pudrowanych, należy również pamiętać o usunięciu pęcherzyków powietrza między membraną a żelem.